酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(一) 原理是酶免疫技術(shù)中應(yīng)用*的一種。在合適的載體上，酶標(biāo)記

抗體或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原抗體免疫復(fù)合物，在一定的底物參與下

，復(fù)合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或還原成另一種帶色物質(zhì)。由于在一定的條件下

，酶的降解底物和呈現(xiàn)色澤是成正比的，因此，可以應(yīng)用酶標(biāo)測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出

參與反應(yīng)的抗原和抗體的種類和含量。ELISA的技術(shù)類型很多，現(xiàn)僅將常用的幾種簡介如下

：

1 間接法主要用于檢測(cè)血清中的抗體，也可檢測(cè)抗原(圖341)。

圖341間接法原理示意圖

2 雙抗體夾心法用于檢測(cè)標(biāo)本中大分子抗原(圖342)的一種方法。

圖342雙抗體夾心法原理示意圖

3 抗原競(jìng)爭(zhēng)法此法也稱競(jìng)爭(zhēng)性抑制法，主要用于測(cè)定小分子抗原(圖343)。其大致

步驟

如下：①使已知的抗體吸附于載體表面；②將可能含抗原的待檢溶液和酶標(biāo)記的已知抗原溶

液以適當(dāng)比例混合，加入已包被的載體孔中；③加入酶底物溶液，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。色深表示

結(jié)合的酶標(biāo)記抗原多，而待檢溶液中未標(biāo)記的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗

原少，而待檢溶液中抗原量多。

圖343抗原競(jìng)爭(zhēng)法原理示意圖

此外還有直接法(檢測(cè)抗原)、雙夾心法(檢測(cè)抗原或抗體)、非標(biāo)記抗體酶法(檢測(cè)抗原或抗

體)等。

(二) 材料和方法(以檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體為例)

1 材料

(1) 聚苯乙烯塑料微量組織培養(yǎng)板：4×10孔，上海塑料三廠生產(chǎn)。

(2) 包被液(pH值96)：NaHCO3 293g、Na2CO3 195g，蒸餾水加

至1 000ml，置4℃保存。

(3) 洗滌液(001mol/L、pH值74PBS)：NaCl 80g、KH2PO402g、N

a2HPO4·12 H2O 29g、KCl 02g、Tween20 05ml，加蒸餾水至1000ml。

(4) 保溫液：牛血清白蛋白(BSA) 01g、005% PBSTween20 100ml，4

℃保存。

(5) 底物溶液(OPDH2O2)

磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH值50)：02mol/L Na2HPO4(284g/L)257ml、01mol/

L檸檬酸(192g/L)243ml、蒸餾水50ml。

底物溶液：磷酸鹽檸檬酸緩沖液100ml、鄰苯二胺(OPD)40mg、30%H2O2 015ml，現(xiàn)

配現(xiàn)用。

(6) 終止液(2mol/L H2SO4)：濃硫酸222ml、蒸餾水1778ml。

(7) 豬流行性腹瀉(PED)抗原：PEDV豬胎腸原代細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融，65℃

30min滅活。最后以3 000 r/min離心30min，取上清分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。抗原的?/span>

白濃度為300μg/ml。

(8) 酶標(biāo)兔抗豬抗體結(jié)合物：按郭春祥方法制備。mol/L比為196，酶結(jié)合

物效價(jià)為1∶10 000。

(9) 被檢豬血清：采自疫區(qū)豬和病豬。PEDV免疫豬血清及健豬血清分別用于

陽性、陰性對(duì)照。

(10) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀：南京華東電子管廠生產(chǎn)。

2 ELISA操作程序(間接法)

(1) 抗原包被：用包被液將PEDV抗原作1∶5稀釋包被反應(yīng)板，每孔100μl，

同時(shí)設(shè)陰性細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)照孔，置4℃過夜。

(2) 洗滌：用洗滌液洗滌2次，每次2min，瀝干。

(3) 加入被檢血清：用保溫液將被檢血清作1∶100稀釋，加入反應(yīng)板相鄰的

兩個(gè)孔中，每孔100μl。同時(shí)作陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照，置37℃孵育1h。

(4) 洗滌3次：方法同上。

(5) 加入酶結(jié)合物：用保溫液將酶結(jié)合物作1∶4 000稀釋，加入反應(yīng)孔

中，每孔100μl，置37℃孵育1h。

(6) 洗滌3次：方法同上。

(7) 加入底物：每孔100μl，置室溫暗盒內(nèi)顯色20min。

(8) 加入終止液：每孔50μl，靜置5min。

(9) 測(cè)定OD值：用檢測(cè)儀，于492nm波長，按儀器使用及制定標(biāo)準(zhǔn)要求調(diào)節(jié)儀

器，測(cè)定各反應(yīng)孔的OD值，記錄結(jié)果。

(三)結(jié)果判定凡檢測(cè)血清P/N值超過14的，均判為陽性。肉眼觀察，凡

反應(yīng)孔的顏色比正常細(xì)胞對(duì)照孔、正常血清對(duì)照孔顏色深者為陽性。

(四) 注意事項(xiàng)

1 在各載體中使用最多的為聚苯乙烯塑料板。不同廠牌，甚至不同批號(hào)的反應(yīng)板吸附性能

往往有很大差異，因此使用前需要加以選擇。方法為：在整塊板上測(cè)定同一標(biāo)本，求出每一

對(duì)孔的平均OD值，將此值與該板的總均值相比，其差值需在±10%以內(nèi)。

2 為了增加聚苯乙烯板對(duì)某些抗原或抗體的吸附作用，可試用鞣酸處理，牛血清白蛋白處

理，改變載體的表面電荷，引入化學(xué)基團(tuán)等方法處理反應(yīng)板。

3 如非特異性吸附較強(qiáng)，需考慮采用封閉等方法排除。

(1) 封閉：可選用4%～10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%馬血清、01%

～25%明膠等。

(2) 去污劑：可阻止非特異吸附，而不影響特異性抗原抗體反應(yīng)。常用的有0

05%～05%吐溫20、吐溫80、01%NP40等。

(3) 高鹽濃度緩沖液：如含05mol/L NaCl及005%吐溫的磷酸鹽緩沖液(pH

值80)。

(4) 縮短孵育時(shí)間：保溫液中加入終濃度4%的聚乙二醇(PEG，MW6 000)

可縮短抗原抗體反應(yīng)的孵育時(shí)間(20min以內(nèi))。

4 由于反應(yīng)板可能存在邊緣效應(yīng)，因此測(cè)定標(biāo)本時(shí)至少要取兩孔的平均值。

5 各種常用的酶標(biāo)反應(yīng)比色計(jì)性能不一，測(cè)定時(shí)需根據(jù)各自的儀器確定閾值。